동일 초점 현미경

동일 초점 현미경 (in vivo confocal microscopy, IVCM)

역사

동일 초점 현미경의 광학적 디자인은 Lukosz의 법칙에 기초하고 있는데, 이는 해상도는 시야 범위의 확장으로 증대될 수 있다는 것이다. 1955년 Marvin Minsky가 처음으로 살아 있는 뇌신경망을 연구하기 위해 동일 초점 현미경을 개발했다. minsky 현미경 집광기(condenser)는 광원의 초점을 보고자 하는 조직의 작은 부위에 집중하고, 현미경의 대물 렌즈의 초점도 같은 조직의 부위에 잡는다. 집광기와 대물 렌즈 모두 같은 초점을 가지기 때문에 동일 초점이라고 부른다. Minsky 현미경이 소개된 이후 광학 이론은 좀 더 세밀하게 개발되고 향상되었다. 현재의 동일 초점 현미경은 한 점의 광원(즉, 회절이 억제된)의 초점이 검체 내의 작은 부위에 집중되고, 동일 초점 검출기는 발생되는 신호를 수집하는 데 이용된다. 이러한 방법은 초점 평면 위아래에서 유도되는 초점을 벗어난 영상의 양을 줄임으로써 수집된 영상에 도움을 주며, X, Y, Z 평면의 해상도를 현격히 향상시킨다.

종류

• TSCM (Tandem Scanning Corp, Reston, VA) : 현재까지 대부분의 생체 내 영상은 TSCM 시스템을 통해 얻으며, 레이저보다 조직 손상을 적게 일으키는 광대역 광원을 사용하여 실시간으로 영상을 생성하기 때문에 생체 내 조직에 사용하기 적합하다. Egger와 Petran은 자르지 않고 염색하지도 않은 뇌, 망막, 기타 장기 등의 조직 블록에서 처음으로 TSCM 영상을 얻었다. 이후 1985년 Boyde가 demineralization, 연삭(grinding) 혹은 기타 다른 파괴적인 처리 기법을 사용하지 않고 골세포에서 영상을 얻었으며, 1986년 Lemp 등은 처음으로 생체 외각막에 동일 초점 이미지 기술을 적용했다. 이러한 안과 영역의 작업에는 수평으로 움직이는 대물 렌즈가 있는 TSCM의 디자인이 좀 더 적합하다.
• HRT III (Heidelberg Engineering, GmBH, Dossenheim, Germany) : 동일 초점 스캐닝 레이저 현미경이며, Rostock Corneal Module을 포함한다. 이 현미경은 raster pattern으로 움직이는 670nm의 레이저 광선(1㎛ 미만의 직경)을 스캔한다. 이 과정은 수평과 수직 방향으로 고안된 스캔 거울을 이용하여 수행된다. 각막으로부터 반사된 빛은 똑같은 두 개의 거울로 탈주사(descan)되고 beam splitter를 통해 광검출기로 향한다. 이 시스템은 일반적으로 63배 대물 렌즈(0.9 개구수)를 사용하고 400㎛×400㎛ 크기의 이미지를 제공한다. 현미경은 해상도와 대비 감도가 뛰어난 영상을 만들고, 개구수가 높은 대물 렌즈를 사용하여 축방향 해상도가 TSCM보다 높다.
• Confoscan 4 (Nidek. Co., LTD, Aichi, Japan) : 다양한 틈새를 가진 실시간 스캐닝 동일 초점 현미경으로 상업적으로 생산되는 검사 기구이다. 이 현미경 디자인은 Masters와 Thaer에 의해 각막 영상에 적용되었다. 세극등 현미경 스탠드에 부착하고 비간섭 조명을 위해 12V 할로겐 램프를 사용하며 현미경과 CCD 비디오 카메라와 접합하여 임상적으로 안구를 검사한다. 이 디자인에서는 독립적으로 조정된 두 개의 틈새가 결합 광학면에 위치해 있다. 실시간 광학 절편을 만들기 위하여 빠른 속도로 진동하는 양면 거울은 각막 평면 위에 생성된 틈새 영상을 스캔하는 데 사용된다. 이 시스템은 40배의 대물 렌즈(0.75개구수)를 사용하고 영상은 460㎛×345㎛이다. 정렬이 자동화되고 스캔 소프트웨어를 탑재하여 사용자 친화적이다. 또한 이 스캔 틈새 디자인은 빛 처리량을 향상시키고 TSCM에 비해 높은 신호대잡음비를 제공하지만 축방향 해상도를 줄일 수 있는데, 이는 약 26㎛로 측정되었다.

검사 방법

1. 각막의 중심이 기계의 중심에 오도록 앉힌 후 환자의 턱 높이를 조절한다.
2. 단안에 먼저 2% proparacaine을 점안하고 immersion gel을 묻혀 팁 끝 부위를 각막에 접촉시킨다.
3. 자동으로 각막의 상피층과 내피층을 오가면서 서너 차례 조직의 영상을 찍는다.
4. 필요한 영상이나 정보를 통해 세포의 형태를 알 수 있으며, Z-scan을 이용하면 각막 전층에 초점을 맺음으로써 각막의 부위별 두께를 측정할 수 있다.

장점

초점을 벗어난 영상을 기존의 광학 현미경보다 효과적으로 제거함으로써 해상도가 더 높은 영상을 제공한다. 광학 절편 능력은 두꺼운 조직 표본의 서로 다른 깊이의 영상을 획득할 수 있게 해주므로 기존의 조직 처리 및 절단 과정이 불필요해졌다.

적응증

살아 있는 대상에 대한 온전한 조직에 대한 연구에 적합하다.

참고